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Examens directs ou portraits des bactéries

Coloration de Gram



  La coloration de Gram



 Cette coloration a été mise au point par le danois Hans Christian Gram  en 1884 et est toujours LA coloration de référence en bactériologie. Elle est basée sur la " différence de perméabilité " des parois bactériennes à l'alcool. Dans un premier temps pour faire simple on va dire qu'il y a 2 catégories :  la première imperméable dite à Gram positif, la seconde perméable dite à Gram négatif.  (
On  verra par la suite qu'il existe bien sûr d'autres bactéries n'entrant pas dans ces 2 groupes)


 
La procédure:


1-  étaler un fragment du prélèvement sur une lame  dégraissée( bien appuyer en  étalant pour "accrocher" celui ci sur le verre.) Laisser sécher à  l'air. (je ne fixe pas à l'alcool car je trouve que cela abime ou est trop aggressif pour le  prélèvement).


2-  Recouvrir la  lame de violet de gentiane dilué au 2/3 dans de l'eau distillée(cette dilution permet de donner une coloration moins dure comme on dit en photographie). Laisser de 5 à 10 secondes.
A ce stade de la coloration , toutes les bactéries se remplissent de violet.


3- Incliner la lame de 45° et verser du lugol. Reposer la lame et laisser ce lugol 5 à 10 secondes. Le lugol forme alors un complexe stable ioduré partout dans le prélèvement et bien sûr dans les bactéries.

4- Laver à l'eau.

5- Décolorer avec un mélange d'alcool(2 volumes) et d'acétone( 1 volume). Pour ce faire incliner la lame à nouveau à 45° en faisant couler ce mélange sur le haut de la lame( ne pas diriger le jet directement sur le prélèvement pour ne pas être trop aggressif sur la décoloration). Regarder la couleur du liquide qui s'écoule et arrêter juste avant qu'il ne devienne transparent.

5- Laver immédiatement à l'eau, abondamment et sur les 2 faces de la lame.
A ce stade tout le prélèvement est décoloré et les bactéries perméables à l'alcool se sont " vidées" de ce complexe bleu.

6- Pratiquer une contre coloration avec de la fushine de Ziehl diluée au 1/10eme: pour ce faire recouvrir la lame de cette fushine diluée pendant 5 secondes environs. A ce moment seules les bactéries décolorées vont se remplir de fushine et apparaitront
rouges au microscope et seront décrites comme bactéries à Gram négatif.
Les autres bactéries apparaissant
bleues depuis l'étape 5 seront décrites comme bactéries à Gram positif.


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